Transformasi Genetik untuk Tingkatkan Produksi Kentang

oleh -13 views
Lili Narsih, Mahasiswa FTB UTS
bankntb

Gunakan Gen Penyandi Lisozim Melalui Perantara Agrobacterium Tumefasiens

Oleh: LILI NARSIH (Mahasiswa Fakultas Teknobiologi Universitas Teknologi Sumbawa)

SUMBAWA BESAR, SR (02/06/2017)

Produktivitas tanaman kentang (Solanum tuberosum L.) Indonesia pada tahun 2012 adalah 16.58 ton/Ha dan menurun pada tahun 2013 menjadi 16.01 ton/Ha. Produksi kentang di Indonesia dihadapkan oleh berbagai kendala. Kendala utama dalam produksi kentang tersebut adalah penyediaan bibit yang kurang bermutu. Selain itu, rendahnya produksi kentang juga disebabkan oleh iklim yang kurang mendukung serta gangguan hama dan penyakit. Iklim di daerah tropis dapat mendukung berkembangnya penyakit.

Bakteri adalah penyebab utama penyakit pada tanaman kentang. penyakit utama pada tanaman kentang disebabkan oleh bakteri adalah penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum dan penyakit busuk lunak yang disebabkan oleh Erwinia cartopora. Layu bakteri ditemukan secara luas, tidak hanya ditemukan di daerah tropis dan subtropis, namun juga ditemukan di daerah temperatur dingin. Penyakit layu bakteri bahkan dapat menurunkan produksi kentang sampai 80%. Penyakit busuk lunak pada umbi dapat menghambat pertumbuhan tanaman kentang. Daerah yang beriklim hangat biasanya didominasi oleh bakteri Erwinia carotovora pv. carotovora sedangkan di daerah dingin atau sejuk di dominasi oleh bakteri Erwinia carotovora pv.atroseptica. Menurut peraturan menteri Pertanian No.93/Permentan/OT.140/12/2011, E. carotovora merupakan jenis organisme pengganggu tumbuhan karantina (OPTK) tingkat 1.

Pengendalian penyakit yang disebabkan oleh bakteri dilakukan dengan menggunakan kultivar tahan pada kentang. Seleksi mikroba rishosfer yang merupakan antagonis terhadap bakteri R. solanacearum. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan transformasi genetik kentang (S. tubersorum) dengan gen penyandi lisozim melalui perantara agrobakterium  tumefaciens untuk memperoleh tanaman transgenik yang tahan terhadap penyakit busuk lunak dan layu bakteri. Manfaatnya adalah untuk memperoleh tanaman transgenik yang mengandung gen penyandi lisozim yang tahan terhadap penyakit layu bakteri dan busuk lunak.

Lisozim adalah enzim yang terdistribusi secara luas, yang bisa ditemukan pada serum, mokus dan beberapa jaringan vertebrata tingkat tinggi. Lisozim ayam telah dilaporkan memiliki aktivitas litik terhadap micrococcus lysodeikticus, Favobacterium columanare, Aeromonas hydrophilla dan Vibrio anguillarim. Adanya aktivitas lisozim dalam membunuh bakteri secara enzimatis menjadikan lisozim sebagai salah satu komponen penting dalam pertahanan organisme terhadap serangan bakteri patogen.

Berdasarkan struktur, sifat katalitik dan karakter imonologinya, lisozim dibagi menjadi 6 tipe yaitu goose-type (G-type), chicken-type (C-type), invertebrate-type (I-type), plant-type, bacterial-type, and Phage-type (Wei et al. 2014). Lisozim yang paling banyak digunakan pada hewan atau tumbuhan budidaya adalah lisozim tipe c (chicken lysozim). Tipe ini merupakan lisozim yang disintesis pada saluran telur ayam. Kajian dari aktivitas litik lisozim telah dilakukan pada F2 ikan salmon transgenik. Aktivitas lisozim pada ikan salamon transgenik adalah 40% daripada ikan salmon non transgenik (Flecher et al. 2011).

Kendala utama dalam produksi kentang di Indonesia di antaranya penyediaan bibit yang bermutu dalam jumlah yang cukup dan pemilihan kultivar yang tepat. Faktor iklim yang kurang mendukung serta gangguan hama dan penyakit. Iklim di daerah tropis sangat mendukung berkembangnya penyakit di antaranya layu bakteri dan busuk lunak.

Perakitan kultivar yang tahan penyakit merupakan metode yang telah dilakukan untuk mengatasi serangan E. carotovora dan R. solanacearum. Sumber sifat ketahanan dalam proses perakitan kultivar unggul dapat diperoleh dengan persilangan beberapa spesies liar dan kerabat dekat. Spesies liar yang diketahui memiliki sifat toleran terhadap penyakit bakteri busuk lunak dan layu bakteri adalah S. phureja. Memperkenalkan metode in vitro kentang terhadap faktor biotik dan abiotik yaitu metode SSICD (Single Seed in Vitro Clonal descent). Teknik inokulasi bakteri R. solanacearum dan E. cartovora dengan metode gunting pucuk memiliki kolerasi yang sangat nyata dengan pengujian dilapangan.

Baca Juga  Peran Pemuda Dalam Bidang Ekonomi

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kentang, koloni bakteri yang digunakan untuk transformasi adalah Agrobacterium tumifasiens strain LBA4404 yang membawa plasmid Pmshi-Iys, sedangkan untuk uji kentang adalah R. solanacearum ras 3 dan E. carotovora ras 1 dari kubis yang berasal dari Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi Tananaman Fakultas Pertanian IPB. Solanum stoloniferum digunakan sebagai kontrol tahan terhadap R. solanacearum dan E. carotovora. Peta daerah T-DNA Pmshi-Iys (Hamdani 2013). Primer 35 S (5’–ATG GCT GGA GTA TTA GCT GGG-3’) digunakan untuk mengidentifikasi tanaman transgenik.

Persiapan eksplan dan perbanyakan planlet yaitu tanaman in vitro kentang diperbanyak dengan menggunakan stek buku tunggal. Stek ditanam pada media MSO (Murashige and Skoog 1962) tanpa zat pengatur tumbuh (MS) dam MS 2 makro (media MSO yang ditambah 1x stok  makro) selama 4 minggu. Eksplan ditumbuhkan diruang kultur  dengan suhu 24-25 C dengan pencahayaan 2000-3000 lux.

Transformasi genetik kentang melalui A. tumefasiens

Agrobacterium tumefasiens asal stok gliserol dikultur selama 36 jam pada media LB cair yang ditambahkan kenamisin 50 mg/L, higromisin 50 mg/L dan steroptomisin 50 mg/L. Bakteri dikultur pada suhu 28 C dalam kondisi gelap, selanjutnya dikultur kembali pada media LB cair selama 18 jam dengan suhu 28 C juga dalam gelap. A. tumefasiens disentrifugasi 6000 rpm, selama 15 menit, endapannya (pelet) dilarutkan dengan media kokoltivasi cair (MS instan 4,6 g/L + vitamin MS + sukrosa 30 g/L +BA 0,5 MG/L +IAA 0,1 mg/L + 20 mg/L asetosiringon).

Eksplan yang digunakan adalah daun dan ruas antar buku (internode). Daun (ukuran 0.5 cm * 0,5 cm) dan internode ukuran 0,5 cm-1 cm, direndam dalam biakan A. tumefasiens OD 0,5-0,7 selama 10 menit. Eksplan kemudian ditanam di medoa kokultivasi (MS instan 4,6 g/L + vitamin MS + sukrosa 30 g/L + BA 0,5 mg/L + IAA 0,1 mg/L + 20 mg/L asetosiringon + agar 2,8 g/L) selama 3 hari di ruang gelap. Setelah dikokultivasi 3 hari, eksplan dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali, direndam dalam larutan antibiotik (sefotaksim 200 mg/L) selama 10 menit, setelah itu eksplan ditanam di media induksi kalus yaitu MS yang ditambahi dengan 2,8 g/L gelrite, 200 mg/L sefotoksin ditanam di media regenerasi yang komposisinya sama dengan media induksi kalus. Tunas yang tumbuh dari kalus dipotong dan dipindahkan ke media MS2 makro.

Hasilnya, transformasi genetik dilakukan menggunakan internode dan eksplan daun tanaman kentang. Efesiensi transformasi tanaman kentang dengan eksplan internode sebesar 16.67% sedangkan eksplan daun sebesar 66.67%. Efesiensi transformasi ditentukan berdasarkan rasio antara eksplan berkalus yang tahan terhadap higromisin dan keseluruhan eksplan yang ditumbuhkan pada media seleksi selama 4 minggu.

Efesiensi pada eksplan daun lebih baik dibandingkan dengan eksplan internode. Perbedaan efesiensi  transformasi antara internode dan daun dikarenakan adanya peristiwa pencokelatan. Pencokelatan (browning) merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap daya hidup sel sehingga berpengaruh terhadap efisiensi transformasi. Pada penelitian ini eksplan internode lebih cepat dan lebih banyak mengalami pencoklatan dibandingkan eksplan daun. Pencoklatan tersebut dikarenakan produksi senyawa fenolik dengan konsentrasi tinggi akibat adanya pelukaan. Pencoklakan pada jaringan muda lebih sedikit dibandingkan dengan jaringan yang tua.

Baca Juga  Perbanyakan Tanaman Sagu (Metroxylon sagu Rottb.)

Aktivitas enzim oksidase yang mengandung tembaga seperti polifenol oksidase dan tirosinase yang disintesis dan tersedia pada kondisi oksidatif ketika jaringan dilukai merupakan faktor pertama yang menyebabkan terjadinya pencoklatan.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa efisiensi regenerasi internode lebih tinggi dibandingkan dengan efisiensi regenerasi eksplan daun. Efisiensi regenerasi pada internode sebesar 20% lebih baik dibandingkan efisiensi regenerasi pada eksplan daun yang nilai efisiensinya sebesar 12.5%. Menurut Leksonowati dan Witjaksono (2011), perbedaan morfogenesis tanaman dengan menggunakan eksplan daun dan internode disebabkan oleh konsentrasi zat pengatur tumbuh endogen yang berbeda dari satu macam eksplan dengan eksplan yang lain.

Untuk identifikasi molekuler, dari 28 tunas transgenik putatif yang dihasilkan, dipilih 2 tunas secara acak dan diuji secara molekuler. Tanaman transgenik tersebut kemudian dinamakan AtLy1 dan AtLy2. Adanya integritas gen lisozim didalam genom tanaman transgenik dianalisis dengan PCR pada DNA Tanaman transgenik adalah primer spesifik 35 S F dan Nos R yang mengapit gen lisozim. Hasil amplifikasi dengan primer ini pada tanaman adalah fragmen DNA yang berukuran 1000 pb, sedangkan tanaman non transgenik tidak menghasilkan amplikon.

Hasil analisis ini menunjukkan bahwa gen lisozim telah berhasil dimasukkan ke dalam genom tanaman kentang kultivar melalui A. tumefaciens sebagai perantara merupakan salah satu metode yang banyak digunakan karena integrasinya yang stabil didalam tanaman.

Tanaman transgenik kemudian diuji tantang dengan menggunakan bakteri R. solanacearum yang merupakan bakteri penyebab penyakit layu bakteri dan E. cartovora yang menyebabkan penyakit busuk lunak pada tanaman kentang. Hasil pengujian terhadap frekuensi penyakit menunjukkan bahwa frekuensi terjadinya penyakit pada klon-klon yang diinokulasikan dengan bakteri R. solanacearum dan E. carotovora berkisr antara 3.33%-100%. Tanaman kentang kultivar transgenik yang mengandung gen lisozim memiliki tingkat kejadian penyakit sebesar 16.67% terhadap R. solanacearum sehingga digolongkan kedalam kategori tahan dan 6.7% terhadap E. carotovora yang juga digolongkan ke dalam kategori tahan. Semua tanaman nontransgenik terserang oleh kedua penyakit tersebut sehingga digolongkan kedalam kategori rentan.

Kentang kultivar transgenik ini dapat dimanfaatkan untuk mempelajari mekanisme pertahanan kentang terhadap inveksi bakteri penyebab penyakit busuk lunak dan layu bakteri. Selain itu, ketika kentang kultivar transgenik ini telah tahan terhadap penyakit busuk lunak dan layu bakteri dapat berguna untuk meningkatkan produksi kentang.

Kesimpulannya, kentang kultivar transgenik yang mengandung gen lisozim di promotor 35 S CaMV dan terminator Nos telah diperoleh melalui transfer gen dengan A. tumifasiens. Dengan menggunakan 240 eksplan, 28 tunas putatif transgenik telah diperoleh. Analisis molekuler 2 tunas transgenik putatif menunjukkan bahwa kedua tunas tersebut adalah transgenik. Eksplan daun memiliki efisiensi transformasi 66.67% lebih baik daripada eksplan internode dengan efisiensi transformasi 16.67%. Efesiensi regenerasi eksplan internode sebesar 20% lebih baik daripada eksplan daun dengan efisiensi regenerasi 12.5%. Inokulasi dengan bakteri patogen terhadap salah satu tanaman kentang kultivar  transgenik menunjukkan bahwa tanaman transgenik tersebut resisten terhadap R. solanacearum dan E. cartovora. (*)

 

 

 

iklan bapenda